jueves, 23 de marzo de 2017

PALABRA

Esta palabra la leí en: ROSAS AMARILLAS PARA GABO (Celso Montaño Balderrama), busqué el diccionario y no lo encontré.  Según el autor este es el significado:

jueves, 16 de marzo de 2017


Estimados universitarios:
A continuacion se detalla la lista de estudiantes repartida casi de forma homogenea en los días de laboratorio, el mismo esta ordenado de acuerdo al promedio de sus notas del primer previo y su informe, el grupo Lunes fue el que tuvo modificaciones, las personas que tengan cruce de horario con otros laboratorios deberan intercambiar con otra persona de otro día (no entre sub grupos), ambas personas deberan estar de acuerdo y presentar una nota hasta el día viernes 17 de marzo hasta las 16 horas., pasado este tiempo no se aceptaran reclamos.   
Para la practica, todos los estudiantes deberan tener un cuaderno empastado de 100 hojas(pequeño) destinado al Laboratorio de Biologia Molecular, forrado de color verde, en el que se realizará:
  • Los protocolos a desarrollar, en esquemas (con minino de letras)
  • Ejercicios o problemas que se deben resolver de las practicas.
  • Observaciones, resultados y correciones los protocolos. 
Ademas, de su respectivo material de limpieza y guantes.
 
Por otra parte, la primera semana trabajara el grupo 1 (posiciones 1 al 9), mientras que el grupo 2 descansa (10 al 18).
La segunda semana trabajarà el grupo 2, mientras el grupo 1 da el examen previo de la practica 3.
Las personas que estan en las siguientes posiciones 8, 9, 10 y 11 deberán traer el siguiente material para la practica:

8 y 10 : Deben traer una jeringa y material para la toma de muestra de sangre.
9 y 11 : Deben traer una botella de 50 mL de alcohol (no alcohol medicinal).
 

lunes, 13 de marzo de 2017

GRUPOS PARA LA PRACTICA 2 (IMPAR)

Estimados estudiantes.  Todos los estudiantes deben presentar en un cuaderno destinado al Laboratorio de Biologia Molecular en el que estarán:

Los protocolos a desarrollar, en esquemas (con minino de letras)
Ejercicios o problemas que se deben resolver de las practicas.

La primer semana trabajara el grupo 1, mientras que el grupo 2 descansa.
La segunda semana trabajarà el grupo 2, mientras el grupo 1 da el examen previo de la practica 3.

Los grupos para la practica 2 son:



jueves, 9 de marzo de 2017

EXAMEN PREVIO DE LA PRACTICA 2

A partir del lunes 13, todos en sus respectivos días darán los examen previos de la practica 2.

Los fundamentos y la lectura complementaria para el previo es el siguiente:



PRÁCTICA 2
EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS
INTRODUCCION
El principal ácido nucleico de la célula es el DNA, esta macromolécula es la más importante de los organismos vivos porque llevan toda su información genética, es así que su extracción es relevante para la investigación de esta molécula, tanto en su caracterización, clonamiento, diagnóstico de enfermedades, determinación de paternidad, estudios genéticos de poblaciones, evolutiva, forense, paleontológica, etc.  En todos estos lo más importante es tener células, considerando que la cantidad extraída de DNA es proporcional a la cantidad de células disponibles.
DNA cromosómico.  Experimentalmente se demostró que la cromatina extraída mantiene la estructura que presenta in vivo, lo que implica que el complejo DNA-proteínas es muy estable, sin embargo, esta propiedad perjudica al aislamiento del DNA intacto, manteniéndose en un 90 % se logra mediante técnicas tediosas.  Por otro lado, los cromosomas de eucariotas y procariotas están acompañados por proteínas de mantenimiento estructural (Structural Maintenance of Chromosome, SMC) que son importantes en la condensación, cohesión de cromátides hermanas, recombinación, compensación de dosis genética.  Por otro lado las proteínas que acompañan a los ácidos nucleicos, pueden ser histonas, no histonicas, y en bacterias HU, IHF y H-NS, mientras que en los virus están unidas a moléculas de la capside.
Se debe tener en cuenta que el DNA por ser una molécula larga y delgada es susceptible a romperse debido a las manipulaciones mecánicas (el simple pipeteo), las químicas (la presencia de DNasas y otros compuestos). Y cuyo tamaño difiere de acuerdo al organismo como se puede observar en la siguiente tabla:
Organismo
Tamaño aproximado del genoma (pb)
l (bacteriófago)
50.000
Escherichia coli (bacteria)
4.640.000
Saccharomyces cerevisiae (levadura)
12.000.000
Arabidopsis thaliana (vegetal)
125.000.000
Drosophila melanogaster (insecto)
170.000.000
Homo sapiens (ser humano)
3.200.000.000
Zea mays (maíz)
4.500.000.000
Amphiuma (salamandra)
765.000.000.000
Además, un tejido puede exhibir gran actividad enzimática, sobre todos nucleásicas como desoxiribonucleasa (DNasa) y ribonucleasa (RNasa), las mismas que son difíciles de inhibir y suficiente para hidrolizar al DNA durante las etapas iniciales de la extracción, por lo que la contaminación con estas enzimas es indeseada, una forma de inhibirlas es utilizando quelantes de iones divalentes, considerando que estos iones son cofactores enzimáticos.
Otros componentes del extracto del tejido son proteínas, lípidos y polisacáridos de los que se debe liberar para obtener DNA puro.
Las muestras para la obtención de DNA cromosoma eucariota pueden estar de acuerdo al siguiente cuadro:


TIPO DE MUESTRAS
ORIGEN
OBJETIVO DE EXTRACCION
Tejido sólido
Tejidos tumorales
Oncogenes, genes de glicoproteínas, receptores.
Tejido hepático
Enfermedades metabólicas (DNA 15 ug/ml)
Tejido muscular
Enzimopatías (DNA 3 ug/ml)
Tejido intestinal
Enzimopatías
Extensiones de piel
Zonas no vellosas, DNA 3 ug/ml
Raíz de pelo
Fines forenses (0,5 ug/raíz)
Huesos
Pulpa de dientes, médula de huesos
Tejidos fijados, Tejidos incluidos en parafina, DNA antiguo (restos humanos y animales), DNA atrapado, etc.
Estudios antropológicos, fijados en formol, momias, en resina vegetal.
Suspensiones celulares
Células embrionarias

Blastómero, estudio en células madre
Líquido o fluido amniótico
Diagnóstico prenatal de anomalías cromosomales, enfermedades metabólicas congénitas, defectos de desarrollo, estudio de sexo, etc.
Células de tejidos o sangre fetales
Vellosidades coriónicas, diagnóstico prenatal
Células de sangre o médula ósea adultas
Estudios genéticos e histológicos
Muestras bucales
Fines forenses o estudios de paternidad (hisopo DNA 8-9 ug/ml)
Semen
En preservativo, aspiración vaginal, lavado de manchas.
Células en cultivo
Estudios genéticos e investigación.
Líquidos biológicos extravasculares
Líquido cefalorraquídeo
Detección de enfermedades del sistema nervioso central y marcadores tumorales
Líquidos o derrames serosos
Peritoneal, pleural, pericárdico
Líquido articular o sinovial, humor acuoso, humor vítreo, lágrimas, endolinfa, moco cervical, vaginal, uñas, heces, etc.
Metabolitos de enfermedades hereditarias relacionadas con el metabolismo.
Los pasos fundamentales de cualquier técnica tienen por objetivos la ruptura de la membrana celular mediante detergentes, desproteinización enzimática (ablandador de carne) y el aislamiento del DNA por precipitación alcohólica.  Las exigencias de cada etapa dependen de la muestra del cual se obtendrá el DNA y tipo de análisis posterior a que se someterá el DNA extraído.
Actualmente se está utilizando para el aislamiento de DNA de muestras de tejido y células, una resina de intercambio iónico, chelex, ésta resina tiene una alta preferencia por cobre, hierro y otros metales pesados, sobre todo cationes monovalentes como sodio y potasio, todos estos iones influyen directamente en la extracción del DNA de ahí su importancia para el aislamiento con alta pureza. Esta resina es eficientemente regenerada en acido diluido y opera en soluciones básicas, neutrales y débilmente ácidos con pH mayor a 4.
Existen muchas técnicas de extracción, que son usadas de acuerdo a los estudios a realizarse posteriormente, la evaluación del rendimiento y pureza, se efectuará en posteriores prácticas.
Actualmente el análisis de DNA se aboca a la búsqueda de secuencias variantes de una región génica, las variaciones en el DNA son importantes para el diagnóstico de enfermedades malignas y genéticas, construcción de mapas de ligamiento y análisis forense.
DNA plasmídico.  Existen elementos genéticos compuestos por DNA fuera del cromosoma en las bacterias que son los plásmidos, las mismas que requieren técnicas muy elaboradas por ser moléculas pequeñas circulares en el que método de lisis alcalina es el más recomendado.
Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosomal, que representan un 1,2 a 3% del genoma cromosomal, se encuentran en la mayoría de las especies bacterianas y en algunas especies eucariotas como hongos y levaduras; su peso molecular fluctúa entre 106 y 108 Dn.  Estas moléculas son circulares, covalentes y cerradas, son autónomas en su replicación y capaces de transferirse a otras bacterias, pero no pueden replicarse fuera del hospedero.
El estudio de los plásmidos es importante porque nos puede dar información valiosa para el análisis filogenético y de epidemiologia molecular.  También, los plásmidos se utilizan como moléculas vectores de clonación de fragmentos de DNA de interés en ingeniería genética.
En el aislamiento de plásmidos grandes (30-40 MDn) se observan bajos rendimientos que probablemente se deba al bajo número de copias por célula y la ineficiente lisis celular, actualmente se hacen varias modificaciones para corregir una buena extracción de plásmidos de grandes pesos moleculares, que no se quiere abarcar en este curso.
La extracción de los plásmidos es importante sobre todo para entender la biomasa, diversidad y las funciones metabólicas en comunidades bacterianas comunes y raras como por ejemplo en el sedimento del fondo del mar, el estudio en estos lugares es muy dependiente de cómo se haya extraído el material genético del cual se sacará información.  No se debe olvidar que las muestras contienen sustancias que pueden perjudicar los procesos posteriores a la extracción. Para tal efecto, (Morono et.al. 2014) estandarizaron las condiciones químicas (alcalino) y físico (temperatura) de un protocolo incrementando (i) la eficiencia de la ruptura celular (más del 80%), (ii) el rendimiento de la extracción del DNA (2.7 a 52 veces más alto que los convencionales) y (iii) la cantidad y diversidad de genes encontrados.
De todos los agentes químicos que se utilizan en protocolos comunes, el SDS (detergente anionico) ayuda a solubilizar proteínas, membranas y restos celulares, para evitar que gran cantidad de DNA quede atrapado en los mismos.  Luego del cual mediante acetato de potasio se puede separar las proteínas desnaturalizadas y polisacáridos
El calor también es un factor físico que ayuda en la extracción y aislamiento del DNA, porque permite desnaturalizar a las proteínas y gracias a la estabilidad del DNA mantenerla en buen estado.  Muchos estudios se han hecho para evaluar la manutención de la calidad del DNA a diferentes temperaturas usando como prueba la amplificación del gen RNA 16S, en la que se demostró que a temperaturas de 50 a 70°C mantiene la calidad del DNA (Fernández, 2008).
Es necesario mantener un cierta fuerza iónica en el medio dependiendo de la concentración de NaCl para poder disolver al DNA.  Las altas concentraciones de NaCl ayudan a la descontaminación con polisacáridos, ya que estos son menos solubles en estas condiciones.
A pesar de todo, es necesario añadir pasos para la purificación y concentración de ácidos nucleicos.  Por ejemplo, el uso de etanol sirve para separar al DNA del extracto, otras técnicas utilizan isopropanol que es más selectivo para DNA en presencia de RNA; en algunas técnicas se agrega PVP (polivinil pirrolidina) para evitar la presencia de polifenoles que darían una coloración gris o parda al extracto de DNA.
En muchos trabajos de investigación los ácidos nucleicos se extraen de suelo, la que no siempre produce DNA de alta calidad para utilizarlo posteriormente en PCR, puesto que el alto contenido orgánico tiene ácidos húmicos con grupos fenólicos que desnaturalizan moléculas biológicas por formación de quinonas que enlazan covalentemente al DNA o proteínas, por lo que, la purificación del extracto debe centrarse en la remoción de compuestos fenólicos, generalmente las técnicas utilizan polivinilpirrolidina que forma puente de hidrogeno con los compuestos fenólicos y los precipita.
RNA Rotaviral.  El rotavirus es un miembro de la familia Reoviridae, que infecta a un gran grupo de mamíferos, su genoma está compuesto por RNA, que en geles de electroforesis se presenta con un típico perfil de 11 segmentos, en base al cual es posible identificarlo y tipificarlo, este método es mucho más sensible y sencillo, que los inmunológicos.
La molécula de RNA, tiene una estructura semejante al DNA, sin embargo es una molécula mucho más lábil y su manipulación requiere más cuidado, la extracción de RNA tiene etapas que aseguran que permanezca intacto y pueda dañarse, los métodos a usarse difieren bastante de acuerdo al tipo de RNA que se quiera extraer.  Moléculas muy pequeñas como los RNAt, RNAr y RNAm, pueden ser extraídas en columnas de intercambio iónico, gradientes de concentración, ultracentrifugación, etc.
El estudio del RNA, es importante para la sistemática molecular (por ejemplo, RNAt, RNAr 16s), determinación de actividad metabólica, ingeniería genética (RNAm).
Muchos de los agentes etiológicos son difíciles de diagnosticar, por la necesidad de equipos sofisticados y caros, como en el caso de los rotavirus, sin embargo, identificarlo puede ser más fácil detectando el genoma viral, directamente de heces fecales de los individuos infectados, y caracterizándolo por electroforesis.
En la práctica, se muestra una técnica sencilla de extracción de RNA a partir de heces fecales con la que se puede detectar la presencia del rotavirus, sin necesidad de recurrir a técnicas más complicadas como: cultivos celulares y microscopía electrónica.



(Parte de metodología) Shotgun of M. massiliensis genome, sequencing strategy, and annotation. DNA was extracted by incubation with 1% SDS and RNAseI at 37°C for 2 h followed by an overnight lytic treatment with Proteinase K at 37°C. After three phenol–chloroform extractions and ethanol precipitation, DNA was resuspended in TE pH 7.5. No plasmid was observed after loading DNA extraction on a 0.6% agarose gel in 13 TBE. Following mechanical shearing, two shotgun genomic libraries were constructed of 4- and 6-kb inserts in pCDNA2.1. A third library was constructed using mini BACs. About 40 ug of genomic DNA was partially digested by Sau3A endonuclease and 10–25 kb DNA fragments were ligated into dephosphorylated BamHI digested pBBC vector. The quality of the library was validated by analysis of 96 clones digested by NotI. Sequencing was carried out using Big Dye 3.1 terminator chemistry on an automated capillary ABI 3700 sequencer. The three libraries yielded respectively 17,497, 23,250, and 10,436 sequencing reads from both ends of inserts, corresponding to a 9-fold coverage of the genome. Sequences were analyzed and assembled into contigs using Phred, Phrap, and Consed softwares taking all sequences into account. Finishing included 568 directed sequencing reactions analyzed on an ABI3100 sequencer. The final assembly contained 99.95% of positions with a Phred/Phrap score above 40. An initial set of protein-coding genes was detected using self-training Markov models and careful examination of intergenic regions to rescue additional ORFs. ORFs were then validated and annotated by sequence similarity using Blastp against the nonredundant protein database from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and the Kegg protein database, and by profile detection using RPSblast and the COG database. Genes encoding tRNA were identified with tRNAscan-SE and other RNAs were located using Blastn.

(Parte de metodología) DNA extraction and PFGE. At each experimental time point, three samples were removed from the freezer, melted at 22°C, and immediately prepared for DNA extraction. The cells were harvested by centrifugation, suspended in a prewarmed buffer (50°C; 10 mM Tris, 50 mM EDTA, 20 mM NaCl; pH 7.2), and embedded in 1.6% low-melting-point agarose (50°C; 1% final concentration) within 15 min of removal from the freezer. To enhance polymerization, the plugs were incubated at 4°C for 10 min. Cell lysis was performed by placing the low-melting-point agarose plugs in a 0.5 M EDTA (pH 8.0) solution containing 1 mg/ml proteinase K, 1% (wt/vol) lauroyl sarcosine, and 1% (wt/vol) sodium dodecyl sulfate and incubating them for 24 h at 50°C. After lysis, the plugs were washed twice in 5 ml of deionized water and four times in TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH7.5, 1 mM EDTA, pH 8.0) for 30 min with agitation. A 2-mm slice was cut from each plug, and the chromosomal DNA was digested with 25 units of NotI in 1x RE buffer (60 mM Tris-HCl, pH 7.9, 1.5 M NaCl, 60 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol) supplemented with bovine serum albumin (BSA; final concentration, 0.1 mg/ml) for 48hat 50°C. After restriction enzyme digestion, the plugs were washed twice in 5 ml of TE buffer as described above. A DNA standard (Saccharomyces cerevisiae chromosomal DNA) was included to facilitate sizing of the fragments and comparisons of migration patterns between individual gels. High-molecular-weight DNAs were separated by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) on a 1% agarose gel containing 0.5XTBE (45 mM Tris-borate, 1 mM EDTA, pH 8.0) at 6 V/cm, with a 120° angle and a ramp switch time from 50 to 90 s over 26 h at 12°C. The separated DNAs were visualized by staining with ethidium bromide. The gel was digitally photographed, and electropherograms were obtained and analyzed with the Bio-Rad Quantity One software package. Background was subtracted using the software’s rolling disk method, and the width and height of the automatically detected peaks were adjusted manually (Quantity One user guide for version 4, Bio-Rad). The shape of each band conformed to a Gaussian model, which was used to mathematically describe the PFGE profiles. The data from each electropherogram were normalized to the highest pixel intensity (i.e., expressed as 100% intensity), allowing individual peaks to be distinguished and compared more easily.